1972年，于佩尔首次出演电影，便是尼娜·康萍兹执导的《福斯汀与美丽的夏天》。情诗、音乐、静谧的湖泊和温柔的夏风，整部影片中不论风景、人还是物，都满溢着夏日浪漫。虽作为配角，于佩尔仍是靠这部作品开启了银幕生涯。

于佩尔首次获得国际目光是在1977年，她出演了克洛德·果雷塔执导的《编织的女孩》，并凭借这部作品获得第30届英国电影和电视艺术学院最佳新人奖和凯撒奖最佳女主角提名。片中，于佩尔饰演一个安静、害羞甚至有些自卑的普通女孩，遇到自己认为的真命天子，又对方不甚在意地提出分手后深受打击，更加封闭在自我的世界。

1978年，于佩尔主演了克洛德·夏布洛尔执导的惊悚犯罪影片《维奥莱特·诺齐埃尔》。告别了充满夏日浪漫气息的少女形象和容易在感情中受伤的脆弱女性角色，在这部影片中，于佩尔挑战出演标志性的“坏女孩”，极尽叛逆，甚至为了遗产谋杀父母。凭借出色的演技，她首次获得戛纳国际电影节最佳女主角奖。

此后，伊莎贝尔·于佩尔不断尝试挑战各种类型的角色。1988年，她搭档弗朗索瓦·克鲁塞主演爱情片《女人韵事》，在片中饰演背着在前线作战的丈夫偷情并做违法私人堕胎生意的女人。出色地演绎如此复杂的角色，让于佩尔一举获得第45届威尼斯电影节最佳女主角奖。

1991年，于佩尔主演名著改编电影《包法利夫人》，饰演在爱情和激情里迷失的艾玛。美丽的艾玛深陷爱情伊始带来的新鲜感中，对稳定的婚姻和乏味的普通生活感到厌烦，更不甘困于自己的社会地位，向往纸醉金迷的上流生活。

1995年，于佩尔出演犯罪片《冷酷祭典》，在片中饰演十分仇富的穷人珍。珍对有钱人的憎恶达到了扭曲的程度，不断煽动好友苏菲与她做佣人的富人家庭决裂，甚至最终计划了血腥谋杀。这部片子让她获得第52届威尼斯电影节最佳女主角奖和第21届法国电影凯撒奖最佳女主角奖。

2000年，于佩尔主演的犯罪片《亡情朱古力》在威尼斯电影节首映。这一次，她饰演的角色酷爱朱古力，表面上是与痛失妻子的好友日久生情的普通女子，实际上却与妒忌、谋杀密切相关。凭借这部影片，于佩尔获得第24届蒙特利尔国际电影节最佳女演员奖。

2001年，于佩尔在迈克尔·哈内克执导的伦理片《钢琴教师》中饰演年近40却一直禁欲的钢琴教师。她气质优雅而出众，但对学生却十分严厉。专制又无理的母亲不断的折磨让她无从发泄自己的欲望，甚至压抑到自残来发泄。直到18岁的冲动男孩闯进她的生活，然而对方却很快厌倦了这种关系。这一角色让于佩尔再度获得戛纳电影节最佳女主角奖。

2012年，于佩尔获得第12届马拉喀什国际电影节颁发的杰出成就奖。同年5月，她在韩国导演洪常秀的爱情片《在异国》中同时分饰三角，三个性格和故事完全不同的“安娜”，分别是法国女导演、婚外恋中的阔太太以及被韩国女人抢走丈夫的“弃妇”。

2016年，于佩尔在惊悚片《她》中饰演游戏公司老板米歇尔。在外人眼里，她冷漠干练，做事雷厉风行，看上去无坚不摧。然而，米歇尔却在某天夜里被闯入家中的蒙面暴徒强暴。作为受害者的米歇尔没有报警，因为父亲曾是臭名昭著的连环杀人犯，这让她抗拒与警方和媒体打交道。然而在决定自己寻找暴徒真面目的过程中，生活又不断给她制造麻烦。凭借《她》，于佩尔提名第32届独立精神奖最佳女主角。影片导演保罗·范霍文曾评价于佩尔道：“如果这个世上没有于佩尔，那就永远不会有这部电影”。